基于PAM-free LAMP-CRISPR/Cas12a (Cas-PfLAMP)的水稻病原體快速現(xiàn)場檢測平臺
水稻細菌性、真菌性和病毒性疾病嚴重威脅糧食生產(chǎn)與安全。現(xiàn)有檢測方法（如傳統(tǒng)培養(yǎng)、qPCR、免疫學方法等）存在依賴專業(yè)設備、耗時、成本高或存在交叉反應等缺陷，無法滿足田間即時檢測（POCT）的需求。
上海交通大學研究團隊開發(fā)了一種無需PAM序列限制的環(huán)介導等溫擴增偶聯(lián)CRISPR/Cas12a檢測新方法（Cas-PfLAMP），并結合側流層析試紙條，用于水稻白葉枯病菌、水稻條紋病毒和水稻黑條矮縮病毒的快速、高靈敏、高特異且現(xiàn)場可視化診斷。
PAM-free LAMP擴增：為避免CRISPR/Cas12a系統(tǒng)對PAM序列（如TTTN）的嚴格依賴，本研究在LAMP引物（FIP）的F2與F1c連接區(qū)（Linker region）預插入了一個TTTT PAM序列，使得擴增產(chǎn)物天然包含可被Cas12a識別的PAM位點。這種“PAM-free”設計極大地提升了方法的通用性和靈活性。
CRISPR-Cas12a檢測：利用設計好的特異性單鏈向導RNA引導FnCas12a蛋白識別并切割含PAM位點的LAMP擴增產(chǎn)物。此過程激活Cas12a的反式切割（trans cleavage）活性，無差別切割反應體系中的單鏈DNA熒光報告探針。
結果判讀：開發(fā)了熒光實時監(jiān)測和側流層析試紙條（LFS） 兩種可視化方案。
熒光法：使用FAM-淬滅基團標記的報告探針，陽性結果釋放熒光。
試紙條法（LFS）：使用FAM-生物素雙標記的報告探針，切割后產(chǎn)物在試紙條上顯示檢測線（T線），結果直觀可視，無需任何儀器。
其中，使用的LFS是來自沃博生物warbio的CRISPR Cas12/13 HybriDetect試紙條,貨號JY0301。
“雙保險”特異性：結合了LAMP引物（識別6個位點） 和CRISPR sgRNA特異性識別的雙重精準識別機制，有效降低了傳統(tǒng)LAMP因非特異性擴增導致的假陽性。
操作簡便：全程恒溫反應（LAMP：65°C；CRISPR/Cas12a切割：37°C），可使用便攜式設備（如智能保溫杯）加熱，非常適合田間操作。
快速核酸提取：配套使用商業(yè)化固相核酸提取試劑盒，無需研磨葉片，5分鐘內即可完成大批量樣品處理。
對于水稻白葉枯病菌（XOO），檢測限為9 拷貝/反應。
對于水稻條紋病毒（RSV） 和水稻黑條矮縮病毒（RBSDV），檢測限均低至3 拷貝/反應。當結合試紙條（LFS）讀數(shù)時，靈敏度略降為9 拷貝/反應。
靈敏度主要得益于LAMP的高效擴增和Cas12a反式切割的信號級聯(lián)放大。
對包括其他黃單胞菌屬細菌、多種水稻病毒在內的總計25種相關病原菌/病毒菌株進行交叉反應測試。
結果顯示，三個Cas-PfLAMP檢測體系均無交叉反應，特異性高達100%，僅對各自的目標病原體產(chǎn)生陽性信號。
從上海交通大學閔行校區(qū)水稻田中采集14份葉片樣本，利用集成了固相提取、便攜加熱和LFS試紙條的完整現(xiàn)場平臺進行檢測。
操作全程僅需約60分鐘（樣品間并行處理）。檢測結果與實驗室傳統(tǒng)PCR/RT-PCR和LAMP驗證結果完全一致，證明了該平臺在實際田間應用中的可靠性和實用性。
本研究成功構建了一個名為Cas-PfLAMP的檢測平臺。該平臺的核心創(chuàng)新點在于通過改造LAMP引物“預埋”PAM序列，突破了CRISPR檢測對靶標序列天然PAM位點的依賴性。結合開發(fā)的全流程現(xiàn)場檢測平臺（提取→擴增→試紙條判讀），該系統(tǒng)實現(xiàn)了對水稻重要病原體的快速（~50-60分鐘）、超靈敏（<10 拷貝）、高特異且無需專業(yè)設備的現(xiàn)場診斷。這一平臺不僅能有效應用于水稻病害監(jiān)測，其“PAM-free”設計理念也可擴展至其他動植物病害及各類核酸即時檢測領域。
|
貨號
|
產(chǎn)品
|
規(guī)格
|
|
TABAS03KIT
|
TwistAmp Basic Kit DNA擴增試劑盒
|
96T
|
|
TAEXO02KIT
|
TwistAmp exo 試劑盒
|
96T
|
|
B8201C1
|
DNA恒溫快速擴增試劑盒（DNA基礎型）
|
48T
|
|
B8202C3
|
DNA恒溫快速擴增試劑盒（DNA熒光型）
|
48T
|
|
B8203C5
|
DNA恒溫快速擴增試劑盒（DNA試紙條型）
|
48T
|
|
B8204C7
|
RNA恒溫快速擴增試劑盒（RNA基礎型）
|
48T
|
|
B8205C9
|
RNA恒溫快速擴增試劑盒（RNA熒光型）
|
48T
|
|
B8206C0
|
RNA恒溫快速擴增試劑盒（RNA試紙條型）
|
48T
|
|
JY0209
|
雙靶標HybriDetect側向層析試紙條（彩虹型）
|
50T
|
|
JY0201
|
單靶標HybriDetect側向層析試紙條（彩虹型）
|
50T
|
|
JY0307
|
CRISPR單酶切及擴增產(chǎn)物檢測試紙條
|
50T
|
|
JY0301
|
CRISPR Cas12/13 HybriDetect試紙條
|
50T
|
|
JY0308
|
CRISPR雙酶切檢測試紙條（變色龍）
|
50T
|
